洛克菲勒大学利用CRISPR电池材料

06-10

2019年5月30日，来自纽约洛克菲勒大学细菌学实验室的LucianoA. Marraffini团队在Nature杂志发表文章——Cas13-induced cellular dormancy prevents the rise of CRISPR-resistant bacteriophage，文章鉴定了Cas13介导的非特异性剪切RNA的能力能够剪切宿主和噬菌体表达的RNA，赋予宿主防御DNA病毒感染和抗CRISPR病毒感染的能力。

细菌的CRISPR（Clustered, regularlyinterspaced, short palindromic repeat）基因座是指被来源于噬菌体和质粒的短片段（spacer）分隔开的30-40bp间隔重复的序列，它和功能与核酸加工相关的CRISPR相关蛋白（CRISPR-associatedprotein, Cas）共同组成细菌的免疫系统。CRISPR基因座可转录出并加工为short CRISPR RNAs （crRNA），介导Cas核酸酶靶向并破坏入侵噬菌体或质粒的互补序列（protospacers），发挥免疫作用。根据效应核酸酶组成的亚基数量，CRISPR-Cas系统可以分为两类：第一类系统的核酸酶由多个亚基组成，根据crRNA加工复合体和核酸酶的组分是否存在交互，可进一步再分为Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ型；第二类系统的核酸酶由单一的，多功能的蛋白组成，并根据核酸酶的结构分为Ⅱ，Ⅴ，Ⅵ型。其中，Ⅵ型系统的核酸酶Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶，在分子诊断方面具有重要的应用价值（Nature | 快速、准确、经济：CRISPR技术在疾病检测中的崛起）。

Cas13被报道既具有切割与crRNA互补的RNA间隔序列前体（protospacers）能力，还具有一种特殊的性质：它可以非特异性地剪切附带RNA，并且这一过程依赖于Cas13切割间隔序列前体的发生。但这一特性的生理意义目前未知。另一方面，通过分析表达Cas13的原核生物的spacer序列，发现其既靶向RNA病毒，又含有靶向双链DNA病毒的序列，说明Cas13在防御DNA病毒的过程中也起到重要作用，但如何发挥功能并不清楚。而这与Cas13的非特异剪切RNA的能力是否相关一直是研究者们关心的问题。

为研究Cas13的功能，作者首先在type VI-A CRISPR–Cas系统的天然宿主Listeria ivanovii（L.ivanovii）中构建了Cas13介导的Listeriaivanovii ΩCRISPRVI抵御φRR4DNA噬菌体感染的模型。通过构建靶向φRR4全基因组的spacer文库，最终筛选到能够有效防御的三条spacer序列：靶向anti-CRISPR区域的spcA，靶向早期裂解基因的spcE和靶向晚期裂解基因的spcL。表达三条spacer序列能够有效降低病毒的感染中心效率（ECOI,efficiency of centre of infection）和裂解量（burst size）（图1），说明Cas13能够介导宿主抵御DNA噬菌体的感染。

图1：Cas13a阻碍了DNA病毒感染。

鉴于三条spacer序列靶向的序列既包括病毒必需基因，也包括非必需基因，作者认为Cas13的非特异RNA剪切功能发挥了重要作用。因此，作者使用RNA-seq和RNA5’端鉴定的方法分析了噬菌体和宿主的转录产物以鉴定Cas13非特异RNA剪切功能的靶标。结果发现，噬菌体和宿主的转录产物都发生了普遍的断裂（图2）。没有观察到晚期裂解基因的表达可能是由于早期基因mRNA被剪切导致功能丧失进而无法激活晚期基因的表达。以上结果表明，Cas13可以广泛地剪切噬菌体和宿主的转录本mRNA。

图2：Cas13广泛剪切噬菌体（A）和宿主（B）的转录本。

作者发现，Cas13的激活显著抑制宿主的生长（图3A），但并不会导致宿主的死亡。并且，Cas13激活会导致宿主对抗生素的耐受（图3B），进一步证明Cas13激活导致宿主进入休眠状态。同时，将表达spcE的菌株与感染敏感菌株共培养，可以显著保护敏感菌株（图3C），说明Cas13限制噬菌体的增殖进而保护未感染的细胞群体。而使用外源质粒激活CRISPR-Cas13系统，也会保护宿主防御噬菌体的感染（图3D），这表明Cas13激活引起的休眠效应足以发挥对噬菌体感染的抵抗作用。以上实验说明，Cas13激活诱导宿主进入休眠状态，从而防御DNA噬菌体的感染。

图3：Cas13诱导宿主休眠进而抑制噬菌体增殖。

根据Cas13广泛的保护作用，作者猜测即使噬菌体群体中的部分个体发生自然突变，导致crRNA不能与靶向RNA配对（escaper），Cas13也能有效地中和这部分噬菌体。为验证此推测，作者构建不与spcA配对的φRR4acr和不与spcE配对的φRR4early两株突变噬菌体，并将其与野生型噬菌体按照1：105混合后感染细菌，发现Cas13能够有效的清除噬菌体，而单独感染突变噬菌体则不能发挥保护作用（图4）。混合另一株肌尾噬菌体A511也得到了类似的结果。相比Cas13，Cas9不具有类似的保护效应。

图4：Cas13激活抵御非靶标的噬菌体感染。

综上，作者鉴定了Cas13非特异剪切RNA的功能在宿主遭遇DNA病毒和突变破坏crRNA识别的病毒感染时发挥保护作用的机制：激活的Cas13非特异剪切宿主和噬菌体的转录本，减少噬菌体表达和宿主体内的病毒DNA复制必须因子，阻断病毒复制；同时诱导宿主进入休眠状态，进一步阻断噬菌体侵染未被感染的细菌。

关于噬菌体

噬菌体（phage）是侵袭细菌的病毒，也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的肠道里，都可以找到噬菌体。

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